蛋白免疫印迹实验电泳技术

优异分离效果的理论基础

技术术语“电泳”是指带电分子在电场力作用下在溶液中的运动。电泳已发展成为一种标准的分子生物学实验室技术，在电场作用下，不同分子量/电荷的分子以不同的速率通过介质泳动，从而实现不同分子之间的分离。

在电场中，蛋白质向带相反电荷的电极移动。蛋白质具有各种大小和形状，并具有和其氨基酸组成相关的电荷。不同的蛋白质具有其特征性的迁移速率。在水性介质中蛋白质的总电荷取决于其酸和碱的离子化程度，其总电荷可以通过缓冲液来控制。因为蛋白质的质量是恒定的，所以其荷质比就会随缓冲液而改变。蛋白质构象也可以通过缓冲液、除垢剂和氧化/还原剂来改变。这些因素可将蛋白质迁移率的差异调整到一定程度，以增强分离效果。在蛋白质电泳中，蛋白质移动通过水性聚合物凝胶中的孔洞，这些凝胶中的孔洞对蛋白迁移产生影响，并将蛋白保留在凝胶中，以便对其进行成像和分析。蛋白质在凝胶电泳中的移动速率取决于电泳系统的性质和蛋白质本身的性质。

影响蛋白质迁移的因素包括：

几乎所有用于蛋白质分离的方法都使用水性聚丙烯酰胺凝胶作为尺寸选择筛。聚丙烯酰胺凝胶就是该技术的名称来源：聚丙烯酰胺凝胶电泳或简称PAGE。当蛋白质在电场力作用下移动通过凝胶时，凝胶的孔结构允许较小的蛋白质以更快的通过，较大的蛋白质则更慢通过。较大和较小蛋白质之间迁移速率的差异就导致了它们在凝胶中的物理分离。

在大多数PAGE实验中，凝胶位于两个缓冲液室之间，并且两个缓冲液之间的唯一电场通路就是凝胶。通常，凝胶垂直放置，因此也称垂直电泳，凝胶在浇铸时采用梳子形成上样孔。在缓冲液室之间施加电场会迫使蛋白质迁移进入凝胶并在凝胶中泳动。通常，通过在样品中添加染料来目视跟踪蛋白质在凝胶中的移动，可以看到随时间的推移，染料在凝胶中的向下移动。如果凝胶电泳时间过长，蛋白质可能会从凝胶上流出。

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质电泳分离示意图。

非变性PAGE是一种在非还原性、非变性样品缓冲液中电泳分离蛋白质的方法，而且电泳在不存在变性剂和还原剂的情况下进行。由于保留了天然的质荷比，蛋白质迁移率由多种因素综合决定。另外，蛋白与蛋白之间的相互作用在分离过程中得以保留，因此某些蛋白质也可能会以多亚基复合物的形式一起迁移，并以不可预测的方式移动。由于保留了天然电荷，蛋白质会根据其电荷向不同电极方向迁移。

SDS对水性缓冲液中蛋白质的影响。 SDS帮助蛋白质变性为杆状构象。 SDS还为蛋白质增加了整体负电荷。

变性后的蛋白上样到孔中。

施加电压，蛋白进入凝胶。存在于凝胶中的氯离子（先导离子）比SDS结合的蛋白电泳速度更快，从而形成离子前沿。甘氨酸离子（尾随离子）从缓冲液流入凝胶，在蛋白条带之后形成另外一个前沿。

蛋白会堆积在氯离子和甘氨酸离子所形成的两道前沿之间。在浓缩胶和分离胶的界面处，丙烯酰胺浓度增加，孔径减小。蛋白进入分离胶时会遇到更大阻力。

蛋白会堆积在氯离子和甘氨酸离子所形成的两道前沿之间。在浓缩胶和分离胶的界面处，丙烯酰胺浓度增加，孔径减小。蛋白进入分离胶时会遇到更大阻力。

分离凝胶的孔径越小，凝胶的分离能力越高。由于样品中所有蛋白质的荷质比是相等的，所以分离仅基于分子量。

每种蛋白会依据其分子量的不同，而分离形成不同的条带。

该方法将除垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）掺入缓冲液中，目前SDS-PAGE已成为蛋白质电泳的最主要形式。蛋白在SDS和变性剂（如还原剂）共同作用下会打开二硫键，并完全解离。此外，SDS与蛋白质非共价结合，赋予了一些新的特征，这些特征有利于蛋白的电泳分离：

结合SDS的蛋白质在凝胶中迁移的速度主要取决于其大小，从而可以根据凝胶中的单独条带位置估算蛋白质的分子量。

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使用不同百分比的聚丙烯酰胺在凝胶上分离各种大小的蛋白质。 低浓度的丙烯酰胺凝胶可更好地分离高分子量蛋白，而高百分比浓度的丙烯酰胺可更好地分离低分子量蛋白。梯度凝胶适合分离分子量范围广泛的蛋白样品。

聚丙烯酰胺凝胶由可以聚合成长链的丙烯酰胺单体溶液，和可以在链之间形成交联的双丙烯酰胺溶液制成。聚合反应通过添加一种活化剂（通常是氧化剂过硫酸铵（APS））而引发，活化剂提供自由基来引发聚合反应。通常，还需要添加一种催化剂，一起促进自由基的形成（通常为四甲基乙二胺（TEMED））。

凝胶百分比是PAGE中蛋白质迁移速率的主要决定因素。聚丙烯酰胺凝胶有两个主要参数：总单体浓度（％T，以g / 100 ml为单位）和交联剂的重量百分比（％C）。通过改变这两个参数，可以优化凝胶孔径，获得对目标蛋白的最佳分离。％T代表了聚丙烯酰胺凝胶的相对孔径，较高的％T表示聚合物与水的比例较高，凝胶的的平均孔径较小。

单体通常为30-40％的储备液，其中丙烯酰胺单体与交联剂的比率不同。acrylamide/bis溶液的19:1、29:1或37.5:1分别代表交联剂浓度为5％，3.3％和2.7％，其中37.5:1是蛋白PAGE分离中最常用的比例。

查看不同分子量的蛋白条带在不同凝胶百分比和缓冲液条件下的凝胶分离效果：

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凝胶还可分为等度胶和梯度胶，等度胶由单一百分比浓度单体聚合制成；梯度胶以变化的单体浓度％T梯度通过浇铸制成。等度胶百分比通常在7.5％和20％之间，典型的梯度胶百分比为4-15％和10-20％。使用蛋白凝胶迁移条带图来指导选择适合样品分离度的凝胶类型。

T要为您的样品选择最佳的凝胶浓度及缓冲液化学组成：

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手工浇铸的凝胶（手灌胶）由丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体溶液制备；先制备组份溶液，然后混合，灌入两个玻璃板胶夹进行聚合反应。丙烯酰胺和双丙烯酰胺是神经毒素，必须小心避免直接接触，及时清除溢出物。注意：丙烯酰胺粉末有吸入危险！此外，溶液在灌注前必须完全脱气，避免在凝胶中形成气泡。总的来说，浇铸过程是手工劳动，不像预制胶一样过程可控，因此与预制凝胶相比，手灌胶过程容易有不规范操作且重现性较低。

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Stain-Free 免染胶是一种新型的聚丙烯酰胺凝胶，有等度胶和梯度胶，凝胶中含一种独特的三卤化合物。该化合物在紫外诱导下可与色氨酸残基反应，产生荧光，所以可通过特定的成像仪在凝胶内或膜上检测到蛋白荧光。活化过程将分子量为58 Da的三卤化物结合至色氨酸残基上，实现了蛋白质的荧光可视化。由于该化合物与蛋白质共价结合，因此可以在凝胶或转印后的膜上成像，而无需其他染色和脱色步骤。该系统的灵敏度与考马斯亮蓝染色相当（色氨酸含量> 1.5％的蛋白质）。当蛋白质的色氨酸含量>3％时，具有优于考马斯染色的灵敏度。

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免染凝胶技术使用户可以在电泳后立即可视化蛋白，验证目标蛋白是否已有效从凝胶转印到膜上，而无需染色/脱色步骤。这可以避免浪费在蛋白电泳和转印上的时间，因为在传统实验中，只有当印迹膜显色时，才知道转印过程是否存在问题。

电泳结束后立即对凝胶进行显色（1分钟）

转印前的凝胶免染结果用于评估样品质量及电泳分离效果。

确认蛋白是否有效转印出凝胶  

转印后的凝胶免染结果用于评估转印效率。

抗体杂交前确认蛋白是否有效转印至印迹膜

转印后的膜免染结果用于评估转印效果。

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缓冲体系的pH和离子组成决定了电泳分离功率范围，并会严重影响聚丙烯酰胺凝胶的分离特性。缓冲体系包括以下使用到的缓冲液：

大多数的 PAGE 电泳都使用不连续的缓冲体系，两个电泳迁移率不同的离子在施加电压时会形成移动边界。蛋白质具有中等迁移率，可使得蛋白样品在电泳开始时堆积（浓缩）到一个狭窄区域。当该区域移动通过凝胶时，凝胶的筛分效应使不同分子量的蛋白质以不同的速率移动。改变缓冲液中使用的离子类型会改变凝胶的分离特性和稳定性。

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蛋白标准品是分子量特征明确的蛋白或重组蛋白混合物，将其与样品一起上样至凝胶中，用于监测电泳分离效果，以及估算蛋白条带的分子量和浓度。

选择合适的蛋白标准品：

蛋白标准品可以是预先染色或未染色的天然蛋白或重组蛋白。预染色的标准品可在电泳过程中直观地显示电泳分离进程，以及指示随后转印至膜的过程。未染色的蛋白标准品可提供更为准确的分子量估算。

重组标准品经过特定设计，如：均匀分布的分子量、具有亲和标签，以便于其他方法检测。这些标准品都通过质谱法确认过其绝对分子量。因每个条带中都包含已知量的蛋白质，所以它们还可以用于估算样品中的蛋白浓度。

天然蛋白标准品由天然蛋白混合而成。预染的天然蛋白标准品可有效监测凝胶分离效果。标准品中蛋白以不同的数量和位置共价结合染料，因此与重组标准品相比，可能会产生更宽的条带，从而使分子量估算得不到理想结果。

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电泳过程中需要电源保持一个参数恒定（电压，电流或功率），而电阻在电泳程中不会保持恒定：当不连续的缓冲离子前沿穿过凝胶时，电阻就会发生变化。在SDS-PAGE中，电阻随着运行的进行而增加。

恒定的电参数设置以及对应的缓冲液体系，会可能导致凝胶在运行过程中热量增加，也有可能会减少。所以，在长时间无人值守的电泳过程中有可能需要使用外部冷却，合适的温度控制会产生均匀及重复的电泳结果。

如在整个电泳过程中电压保持恒定，则电流和功率（热量）会随着电阻的增加而降低，同时导致运行时间增加，而蛋白条带有更多的时间扩散。但随着温度的降低，扩散速率随温度的降低也会抵消掉这一点。当并行运行多个凝胶时，通常首选使用恒电压，以确保凝胶上施加的电压是明确可控的。

如果电泳期间电流保持恒定，那么电压、功率及凝胶的热量则在运行期间增加。恒流运行比恒压运行时间短但凝胶温度高。热量的增加加快了蛋白条带的弥散速度，如不进行额外制冷，会导致条带的弥散。

保持电泳功率恒定可将凝胶过热风险降至最低。某些品牌/型号的电源不提供这种恒功率控制模式，一些凝胶制造商也不一定提供恒定功率的建议设置。

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洗净上样孔 在加样之前，用移液枪从上缓冲液室吹洗每个上样孔。这有助于洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣，避免畸形条带的出现。

避免凝胶过热 如果凝胶在电泳过程中温度过高，则条带可能会出现“微笑”形状，即条带两侧向上弯曲的现象。如果缓冲液使用不当，或电泳功率过高，都可能导致凝胶过热。

确保样品缓冲液离子强度正确 样品中的盐离子强度过高（或过低），都会导致条带出现偏斜或扭曲。

不要过载上样 加大上样量有利于检测到稀有目标蛋白。但是，过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。对于较大的上样量，可将电泳电压降低 25％，有助于减少条纹。

电泳理论和技术介绍，以及如何使用Bio-Rad产品解决常见实验问题。

所有Bio-Rad蛋白标准品及核酸标准品的参考信息。

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来自于Bio-Rad Western Blotting技术专家的实验技巧与技术材料

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